聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)抑制剂通过损害癌细胞的DNA修复活性，为乳腺癌和卵巢癌患者提供了临床益处。虽然这些药物延长了许多患者的无进展生存期，但反应可能是短暂的，许多患者最终进展。鉴定增加癌细胞对PARP DNA修复活性依赖性的组合伙伴可能是增加PARP抑制剂效用的一种策略。蛋白精氨酸甲基转移酶5 (Protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)通过剪接和蛋白修饰调节DNA损伤反应通路，PRMT5抑制剂最近进入临床试验。
采用高含量免疫荧光成像技术检测PRMT5抑制对DNA损伤和修复标志物γ - h2ax、RAD51和53BP1水平的影响。在体外乳腺癌和卵巢癌模型中，使用细胞系和体外患者来源的异种移植物来评估PRMT5和PARP抑制剂组合的抗增殖活性。最后，在体内异种移植细胞系模型中评估PRMT5和PARP抑制剂的联合作用。
GSK3326595抑制PRMT5导致DNA损伤标记物水平升高。将GSK3326595添加到PARP抑制剂niraparib中，导致乳腺癌和卵巢癌细胞系以及患者衍生的球体的生长抑制增强。在体内，联合用药改善了单药对肿瘤生长抑制的部分作用，使肿瘤完全停滞和消退。
这些数据表明，在乳腺癌和卵巢癌模型中，抑制PRMT5可诱导DNA损伤的特征。此外，与PARP抑制剂Niraparib联合，体外和体内抗肿瘤活性增强。总的来说，这些数据表明，抑制PRMT5是扩大和增强PARP抑制剂临床应用的一种机制。
聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)参与了一系列生物过程，包括应激反应、染色质重塑和DNA损伤反应，特别是在单链DNA断裂位点[参考文献1]。PARP活性受到抑制后，这些损伤无法修复，导致形成双链DNA断裂，可通过精确同源重组(HR)途径或容易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径修复[参考文献2]。在缺乏HR通路的细胞中，dsb的修复默认为NHEJ，其中不准确修复的病变的持续积累最终导致活力丧失[参考文献3]。作为癌症治疗，PARP抑制剂已被证明对HR必需基因突变的患者有临床益处，包括BRCA1或BRCA2[参考文献4]。除了阻止单链断裂的修复外，PARP抑制剂还将PARP酶困在染色质上，产生额外的DNA损伤并进一步加速基因组的不稳定性[参考文献]。[5,6,7]。尽管PARP抑制剂在临床上取得了成功，但许多患者没有反应，导致短暂的治疗反应[参考文献]。8、9)。因此，正在探索联合用药，以增加PARP抑制剂对更多患者群体的反应持续时间和质量，包括那些具有熟练HR通路的患者[参考文献]。10、11、12、13)。
蛋白精氨酸甲基转移酶(PRotein Arginine MethylTransferases, PRMTs)通过对大量蛋白质上的精氨酸残基进行甲基化，在细胞生物学中发挥着多种作用。精氨酸甲基化存在三种形式，即单甲基化(MMA)、不对称二甲基化(ADMA)和对称二甲基化(SDMA)，每种甲基化状态都会影响蛋白质的功能或定位[参考文献]。14、15)。大多数细胞SDMA是由PRMT5催化的，并且[文献16]。PRMT5的过表达与胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌和胃癌的不良预后和生存相关(参考文献)。17, 18, 19, 20)。因此，已经开发了几种PRMT5抑制剂，包括GSK3326595和JNJ-64619178，目前正在进行临床试验研究[参考文献]。[20,21,22]。
PRMT5介导的甲基化调节剪接体的组装和功能，通过组蛋白甲基化调节转录沉默，以及肿瘤抑制活性[参考文献]。[23,24,25]。PRMT5通过DNA损伤修复蛋白的甲基化或转录本的选择性剪接，参与DNA损伤反应的调节。53BP1是NHEJ所需的蛋白，而PRMT5的精氨酸甲基化是稳定53BP1所必需的，从而降低了其活性[参考文献26]。在造血细胞中，PRMT5调节组蛋白乙酰转移酶TIP60的剪接，促进HR通路的利用，而PRMT5缺失引起的TIP60剪接异构体的改变增加了NHEJ的使用[参考文献]。27、28)。PRMT5调节也通过消耗RPA损害同源重组，导致易受吉西他滨DNA损伤[参考文献29]。因此，通过抑制PRMT5调节DNA损伤反应和修复蛋白可能会增加癌细胞对PARP抑制的敏感性。为了探索这一假设，我们评估了一种有效的、选择性的临床PRMT5抑制剂GSK3326595对DNA损伤反应途径的影响，并在hr熟练的人类癌症模型中评估了与PARP抑制剂niraparib联合使用的疗效。在体外，PRMT5抑制增加了乳腺癌和卵巢癌细胞系的DNA损伤标记物，并且与PARP抑制剂联合在癌细胞系和3D克隆源性患者来源的异种移植(PDX)模型中产生了增效生长抑制。在体内，联合治疗分别导致乳腺癌和卵巢癌异种移植模型的肿瘤停滞和消退，而每种单一药物仅部分影响肿瘤生长。总之，这项工作证明了靶向PRMT5活性的效用，以扩大PARP抑制的治疗效益。
细胞系是从不同的存储库获得的，并获得相应的许可。美国国立卫生研究院细胞系是由美国卫生与公众服务部(Department of Health and Human Services)和dr。加兹达尔和米纳。所有细胞系均保存在推荐的细胞培养基中，温度为37℃，CO2浓度为5%。所有细胞系的鉴定均通过短串联重复谱验证，每个细胞系均使用ATCC通用支原体检测试剂盒证实支原体阴性。GSK3326595和尼拉帕尼从GSK药物化学公司获得，在100% DMSO中以40 mM的原液制备。依托泊苷(Millipore, MA)在100% DMSO中制备为20 mM的原液。
细胞在复合处理前24小时接种，一式三份，透明底96孔板(Perkin Elmer, MA)。细胞用DMSO或9点3倍稀释系列GSK3326595 (10,000 nM - 1.52 nM)处理。在复合处理第5天，细胞分别用DMSO或10μM依托泊苷处理。24 h后，细胞用4%甲醛固定，清洗，并用IF缓冲液(1X PBS + 0.1% w/v BSA + 0.2% Triton-X, 0.05% Tween-20 + 10%山羊血清)在室温下阻断2小时。然后将细胞与抗RAD51(1:1500，目录# ab133534, Abcam Cambridge, UK)， 53BP1(1:10 00，目录# 4937,Cell signaling Technologies, MA)， γH2AX(1:50，目录# 5-636,Millipore, MA)或抗geminin (1:250, Abcam，目录# ab195047, Cambridge, UK或1:100，目录# MABS121, Millipore, MA)的抗体一起孵育，在4°C下孵育过夜。细胞用IF缓冲液洗涤4次，用抗小鼠alexa 488(1:1000，目录# A32723, Invitrogen, MA)、抗兔alexa 633(1:1000，目录# A21071, Invitrogen, MA)和Hoechst (1:2000, ThermoScientific, MA)在室温下避光染色2小时。使用Perkin Elmer Opera phoenix共聚焦显微镜进行免疫荧光染色成像。每个通道的每口井39-60个视场(FOV)， DAPI, alexa 488, alexa 633使用40倍的水物镜拍摄。使用Perkin Elmer Harmony软件对图像进行分析。首先，利用赫斯特染色的信号识别完整的细胞核。确定核双敏染色的平均荧光强度(MFI)， MFI > 750为双敏阳性，< 750为双敏阴性。采用滑动抛物线法检测RAD51、53BP1和γ - h2ax斑点，采用阈值法识别病灶。RAD51或53BP1病灶≥5个为全核阳性，γH2AX病灶≥15个或γH2AX MFI > 2000为全核阳性。计算每孔双阳性细胞(标记阳性和双阳性)占双阳性细胞总数的百分比。如果gemini阴性或gemini阳性的总群体少于100个细胞，那么这些群体将被排除在进一步的分析之外。
OVCAR3细胞以5 × 104个/孔的速率接种于96孔板。接种24小时后，根据制造商的协议，使用Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen, Waltham, MA)转染1 pmol非靶向siRNA (Dharamacon, Lafayette, CO)， brca1特异性siRNA (Dharamacon, Lafayette, CO)或tp53bp1特异性siRNA (Dharamacon, Lafayette, CO)。转染72小时后，细胞分别用0.1% DMSO或10μM依托泊苷处理24小时。
双滴定增殖实验如前所述完成[参考文献30]。细胞系用2倍稀释的GSK3326595或浓度为10,000 nM至0.3 nM的尼拉帕尼处理。共处理包括GSK3326595的稀释剂水平沿平板注射，尼拉帕尼的稀释剂垂直沿平板注射。所得的药物浓度基质允许每一种浓度的GSK3326595被每一种浓度的尼拉帕尼所镀。37℃，5% CO2孵育10天。在治疗的第10天，根据制造商的方案，使用CellTiter-Glo (CTG) (Promega, WI)裂解细胞，使用Synergy Neo板读取器(Biotek, VT)检测化学发光信号。通过低密度在24孔板上播种细胞来完成长期增殖实验。然后用5倍稀释系列的GSK3326595处理细胞，浓度范围为5000 nM至8nM，单独或与400 nM, 1000 nM或2000 nM的尼拉帕尼联合。处理14天后，取出细胞培养基，用0.5% w/v结晶紫在含2.7%多聚甲醛和1%甲醇的1X PBS中室温染色30min。去除污渍，用连续流动的水洗涤盘子，直到去除多余的结晶紫。在成像前，钢板被允许风干过夜。如前所述，使用CTG治疗14天后测量增殖。处理后，细胞生长的抑制作用以化合物添加时(T0)存在的细胞数量的百分比表示，如前所述[参考文献]。30、31)。根据前面的描述计算相对抑制作用和生长/死亡指数(GDI)， GDI是细胞生长和细胞死亡的综合代表[30]。生长死亡指数剂量响应拟合采用四参数曲线方程Y=Bottom +(Top-Bottom)/1(1+(IC50/X)HillSlope。采用Bliss模型计算，根据计算公式Ea + Eb-Ea*Eb获得的单个药物浓度的抑制作用，确定每种组合浓度的预期抑制作用，其中E为效果(抑制作用)，a为GSK3326595, b为尼拉帕尼[参考文献32]。此外，通过减去任一单一药物最有效的生长效应所观察到的相对生长抑制，采用最高单一药物模型计算。两个模型的期望值和观察值之间的差异被确定，其中≥10被认为是协同效应，?10和10之间的值被认为是加性效应，≥-10被认为是拮抗效应[30]。
3D肿瘤克隆性PDX实验在Charles River实验室进行，将PDX肿瘤单细胞悬液置于96孔超低附着板中，在IMDM中加入0.4% (w/v)琼脂(Bd Biosciences, MA)，并添加20%胎牛血清(Sigma-Aldrich, MA)和50ug/mL庆大霉素(Life Technologies, CA)，建立3D PDX球体。电镀24 h后，用含有GSK3326595的培养基覆盖软琼脂层，培养基浓度范围为10μM至3.16μM，单独或与固定浓度1.8μM或0.57μM的尼拉帕尼联合使用，持续8至13天。处理期结束后，用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四氯化物(INT) (Sigma-Aldrich, MA)染色，并使用自动成像计数。处理组剩余大于50 μm的菌落数表示为对照组的一小部分。采用四参数非线性曲线拟合确定GSK3326595单药活性。IC50和绝对IC50值分别从顶部或底部平台和/或增长率为对照的50%的中点确定。所有IC50值的几何平均值用于测定GSK3326595的效价。如前所述，过量幸福或HSA由控制百分比确定。
MDA-MB-468异种移植物由GlaxoSmithKline (GSK, PA)进行，OVCAR3异种移植物模型由Charles River Laboratories (CRL, MA)进行。所有小鼠在GSK或CRL的特定无病原体屏障设施中维持。所有的研究都是按照葛兰素史克关于实验动物的护理、福利和治疗政策进行的，并由葛兰素史克的机构动物护理和使用委员会或工作所在机构的伦理审查程序进行审查。将3 × 106 MDA-MB-468细胞的100% Matrigel单细胞悬液皮下递送至雌性NSG小鼠后腹。通过在10周龄雌性CD.17 SCID小鼠(Fox Chase SCID?，CB17/Icr-Prkdcscid/ icricocl, Charles River, MA)的后侧皮下连续植入约1mm3肿瘤片段，建立OVCAR-3异种移植物。一旦肿瘤生长明显，肿瘤体积和体重每周测量两次。用卡尺测量肿瘤体积，计算公式如下:肿瘤体积=(长x宽2)/2。当MDA-MB-468的平均肿瘤大小达到~ 150-250mm3或OVCAR3的平均肿瘤大小达到100-150 mm3时，采用分层块随机化方法将动物随机分为研究组(n=10/组)，动物每天给药2次50mg /kg GSK3326595，或每天给药1次35mg /kg尼拉帕尼，或联合用药。每天对动物进行监测，并记录临床观察结果。研究人员没有对小鼠异种移植研究盲目。采用普通AVOVA检验和tukey多重比较检验，事后检验来确定治疗组之间的显著性。
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为了评估PRMT5抑制对DNA损伤的影响，我们使用了一种成像方法来评估在临床PRMT5抑制剂GSK3326595(简称PRMT5i)的剂量反应下，三个卵巢癌和一个乳腺癌细胞系的DNA损伤水平(磷酸化组蛋白H2AX， γH2AX)。除了单独的PRMT5i外，在治疗的最后一天加入拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷，增加DNA损伤，进一步刺激DNA损伤反应和修复途径的激活。单独使用依托泊苷处理24小时后，γ - h2ax阳性细胞增加(补充图1A, D)。有趣的是，抑制PRMT5导致所有细胞系中γ - h2ax阳性细胞的剂量依赖性积累，并且在OVCAR-3中，依托泊苷处理进一步增加了γ - h2ax阳性细胞的数量(图1A, B)。由于观察到γ - h2ax和DNA损伤增加，我们确定DNA修复机制是否受到PRMT5抑制的影响。我们通过siRNA介导敲除控制同源重组(BRCA1)和非同源重组(53BP1)之间选择的蛋白后，对具有RAD51和53BP1灶的细胞进行定量，验证了高含量成像法测量同源重组和NHEJ通路活性的能力。由于同源重组只有在同源DNA模板可用时才有活性，因此对细胞进行双联蛋白反染以标记细胞周期的S/G2期[参考文献33]。用非靶向对照siRNA、BRCA1 siRNA或TP53BP1 siRNA转染OVCAR3细胞72小时，然后用DNA损伤剂依托泊苷处理(补充图2A)。BRCA1的敲低导致RAD51阳性细胞的减少，同时53BP1阳性细胞的增加(补充图1B, C)。TP53BP1 mRNA的敲低具有相反的作用，导致RAD51阳性细胞增加，而53BP1阳性细胞的百分比下降(补充图1B, C)。这种转换揭示了这种高含量测定能够辨别调节HR介导的DNA修复的生物学后果(补充图1D, C)。E).单独或联合依托泊苷抑制PRMT5后监测53BP1和RAD51病灶。与增加的DNA损伤一致，在所有测试的细胞系中，单独依托泊苷处理增加了RAD51和53BP1阳性细胞的频率(补充图1B-D)。尽管在所有细胞系中γ - h2ax增加，但单独抑制PRMT5或与依托泊苷联合抑制对HR或NHEJ标记物的影响各不相同。在CaOV3(一种卵巢癌系)中，PRMT5抑制降低了HR和NHEJ标记物，尽管增加了H2AX。(图1C, D)总的来说，这些数据表明，抑制PRMT5会导致DNA损伤增加，但对主要DNA修复途径的标记物没有一致的影响。
图1
抑制PRMT5增加复制癌细胞系DNA损伤标记物。A, GSK3326595处理的细胞中geminin(一种复制标记物)和γH2AX(一种DNA损伤标记物)阳性的百分比变化，由DMSO或etoposide处理的细胞通过免疫荧光测量。双联蛋白MFI > 750的细胞被认为是双联蛋白阳性，MFI > 2000或每个细胞核> 15个病灶的细胞被认为是γH2AX阳性。绘制双球蛋白和γ - h2ax阳性细胞百分比的变化(每个细胞系n=2，每个细胞系2个技术重复)。B, DMSO或GSK3326595处理6天CaOV3细胞的代表性免疫荧光图像。细胞用抗γ - h2ax、抗gemini和核染色Hoechst染色。使用40倍物镜拍摄的免疫荧光图像。比例尺代表50 μm。C, gsk3326595处理的细胞中geminin和RAD51 (HR介导的DNA修复标志物)阳性的百分比变化，由DMSO或依托opo苷处理的细胞通过免疫荧光测量。每个细胞核> 5个病灶的细胞被认为是RAD51阳性(n=2个生物重复，每个细胞系2个技术重复)。D, GSK3326595处理的细胞中geminin和53BP1 (NHEJ介导的DNA修复的标记物)阳性的百分比变化，从DMSO或etopo苷处理的细胞中测定。每个细胞核有> 5个病灶的细胞被认为是53BP1阳性(每个细胞系n=2)。所有误差条表示平均值±SEM。
Niraparib是一种有效的PARP活性抑制剂，能够在染色质上捕获PARP酶，导致DNA损伤和细胞死亡[参考文献]。34、35、36、37、38)。Niraparib目前被批准用于HR缺陷晚期卵巢癌或作为晚期和复发铂敏感卵巢癌的维持治疗，无论HR状态如何[参考文献39]。为了确定尼拉帕尼的抗增殖活性是否可以通过抑制PRMT5来增强，我们对同源重组熟练的乳腺癌和卵巢癌细胞系进行了抗增殖作用的评估。我们采用双滴定法，用不同浓度的尼拉帕尼检测不同浓度的PRMT5i[参考文献]。30、31)。细胞生长以添加化合物时存在的细胞数量的百分比表示，生长死亡指数(GDI)是相对于载体的生长抑制和细胞死亡的综合表示，用于评估组合的效果。Niraparib在测试的细胞系中表现出有限的活性，其gIC50比敏感的BRCA1突变细胞系MDA-MB-436高10至100倍，这表明这些细胞系可以被认为对PARP抑制具有抗性(补充图3A, C)。GSK3326595在所有测试的细胞系中都比Niraparib更有效(补充图3B, D)。或RAD51与对这两种单一药物的敏感性无关(补充表2)。然而，一种被描述为HR缺失和高水平NHEJ的细胞系OVCAR3是对尼拉帕尼和GSK3326595作为单一药物最敏感的细胞系，这表明这种组合对HR丰富和缺乏的癌症都有有益的影响[参考文献40]。为了确定组合对细胞生长的影响是否具有协同作用，采用Bliss独立性(Bliss)或high over Single Agent (HSA)模型，使用相对生长抑制来确定加性和协同效应[参考文献]。[32,41,42]。BLISS独立模型采用方程Ea + Eb-Ea*Eb计算，其中E为效应(抑制)，a为GSK3326595, b为尼拉帕尼[参考文献32]。HSA模型是通过减去观察到的相对生长抑制量来计算的。协同得分大于10被认为是协同的，得分在- 10到10之间是相加的，得分小于- 10被认为是拮抗的[参考文献]。13日,30)。经过10天的培养，在每种单一药物产生细胞抑制反应的浓度下，4种乳腺癌细胞系中有1种的细胞毒性增加(图2A)。使用任何一种协同计算方法，在5000 nM至9.77 nM的浓度范围内，在所有乳腺癌细胞系中观察到GSK3326595和5000 nM至78.1 nM的尼拉帕尼对生长抑制的协同效应(图2B, C)。在BLISS和HSA模型中，在最低或最高浓度的测试中，两种化合物都没有效果，或者通过单一药物治疗实现完全的生长抑制，都观察到拮抗作用。这可能反映了在生长抑制的极端情况下的微小变化(图2B, C)。在卵巢癌细胞系中，在四种细胞系中有三种观察到对该组合的细胞毒性反应(图3A)。与乳腺癌细胞系类似，通过协同计算，这两种组合产生了不同的协同作用区域(图3B, C)。基质方法表明，PRMT5i和尼拉帕尼在乳腺癌和卵巢癌细胞系中都有联合作用的好处，然而，在高浓度的任一抑制剂下观察到大多数细胞毒性反应。
图2
联合抑制PRMT5和PARP对乳腺癌细胞系的抗增殖作用增强。A, GSK3326595和尼拉帕尼双滴定联合治疗乳腺癌细胞系的平均生长死亡指数。联合处理细胞系10 d，用CTG法测定细胞生长情况(每个细胞系n=3)。B，通过GSK3326595和尼拉帕尼双重滴定处理的乳腺癌细胞系的生长抑制计算的平均超额超额Bliss协同评分。值≥10为协同作用，值≤-10为拮抗作用。C，用GSK3326595和尼拉帕尼双重滴定处理的乳腺癌细胞系的HSA协同作用评分的平均超额。值≥10为协同作用，值≤-10为拮抗作用。(每个细胞系n=3)
图3
联合抑制PRMT5和PARP对卵巢癌细胞系的抗增殖作用增强。A, GSK3326595和尼拉帕尼双滴定处理卵巢癌细胞系的平均生长死亡指数。联合处理细胞系10 d，用CTG法测定细胞生长情况(每个细胞系n=3)。B，通过双重滴定GSK3326595和尼拉帕尼处理的卵巢癌细胞系的生长抑制计算的平均超额超额Bliss协同评分。C，双重滴定GSK3326595和尼拉帕尼处理卵巢癌细胞系的HSA协同作用平均超额评分。对于B和C，值≥10为协同作用，值≤-10为拮抗作用。(每个细胞系n=3)
我们假设，在较低浓度下，增加暴露于该组合的时间可能会显示出额外的协同生长抑制或细胞毒性。为了验证这一点，我们评估了一种持续时间较长的菌落形成试验(CFA)格式。最小的细胞间接触和低生长信号产生应激环境，可用于评估治疗的体外细胞毒性作用[参考文献]。[43, 44, 45]。我们通过使用细胞滴度Glo (CTG)来修改CFA，以更可靠地量化细胞生长。在双滴定基质中评估的细胞系以低密度播种以促进菌落生长，然后处理GSK3326595，尼拉帕尼或联合处理14天。与10天的乳腺癌细胞系双滴定增殖试验相比，该试验格式显示，每种单一药物的生长抑制或细胞毒性都有所增加(图4A，补充图4)。这种组合导致MDA-MB-468和HCC38的细胞毒性增加，其中任一单一药物在相似浓度下观察到细胞抑制反应(图4A)。尽管增加了细胞毒性和生长抑制，但在使用任何协同模型测试的所有乳腺癌细胞系中，联合作用主要是对生长抑制的附加作用(图4B, C)。同样，与10天双滴定基质增殖研究相比，卵巢癌细胞系对这两种单一药物的敏感性都有所增加(图4D，补充图5)。在相同浓度的GSK3326595或尼拉帕尼引起细胞抑制反应的OV-90中，观察到细胞毒性增加(图4D)。与乳腺癌细胞系类似，在这种实验形式中，这种组合主要是加性的(图4E, F)。在两种肿瘤类型中观察到的加性效应可能是由于相对于10天的双滴定增殖实验，在较低浓度下，任何一种单一药物都减少了生长窗口。总的来说，暴露时间和环境压力的增加增加了乳腺癌和卵巢癌细胞系对PRMT5、PARP及其联合抑制的敏感性。
图4
在乳腺癌和卵巢癌细胞系长期暴露后，通过抑制PRMT5、PARP及其组合，增加了生长抑制和细胞毒性的效力。A, GSK3326595联合固定浓度的尼拉帕尼处理乳腺细胞系的平均生长死亡指数。低密度播种细胞系，并用该组合处理14 d。CTG法测定细胞生长(每个细胞系n=2)。B，用GSK3326595和尼拉帕尼滴定处理的乳腺癌细胞系的平均超额超额Bliss协同评分。值≥10为协同作用，值≤-10为拮抗作用。C, GSK3326595和尼拉帕尼双滴定处理乳腺癌细胞株的平均HSA协同评分。值≥10为协同作用，值≤-10为拮抗作用。(每个细胞系n=2)。D，用GSK3326595和尼拉帕尼联合处理的卵巢癌细胞系的平均生长死亡指数，如(A) E，用GSK3326595和尼拉帕尼处理的卵巢癌细胞系的平均超额超额Bliss协同作用评分，如(B) F，用GSK3326595和尼拉帕尼处理的卵巢癌细胞系的平均超额HSA协同作用评分，如C
患者源性异种移植(PDX)模型已被用作更好地研究肿瘤特征和预测药物敏感性的有力工具。而癌细胞系的延长培养可能导致继发性分子变化，PDX模型更好地保留了患者肿瘤的原始特征[参考文献46]。因此，我们在13例乳腺癌和9例卵巢癌PDX模型中使用体外3D球形克隆实验测试了尼拉帕尼与GSK3326595的联合应用。该方法测量了半固体培养基中PDX肿瘤单细胞悬浮液中球体的锚定独立生长，并在体内模型中高度预测了靶向药物的功效[参考文献47]。根据模型的不同，用固定浓度的尼拉帕尼滴定GSK3326595处理已建立的3D球体8至13天，并评估菌落活力。单独使用GSK3326595处理降低了多个模型的活菌菌落数量，其中超过一半的模型观察到IC50小于1μM的最大抑制大于50%(补充图6A)。单独使用尼拉帕尼治疗对PDX模型的影响更有限，在最高浓度的尼拉帕尼测试中，22个PDX模型中有6个模型的抑制作用大于50%(补充图6B)。对GSK3326595或尼拉帕尼的敏感性与BRCA1或BRCA2突变状态或肿瘤类型无关(补充图6)。在乳腺癌和卵巢癌PDX模型中，仅使用最不严格的HSA模型观察到协同作用(图5A-B，补充图7,8)。在HSA协同作用的模型中，联合用药在抑制MAXFHER 857和OVXF OV109模型的增殖方面表现出最强的益处(图5C-D，补充图7,8)。这些数据表明，PRMT5和PARP抑制剂联合使用可增加HSA的抗增殖活性，其作用范围从添加到协同，取决于所使用的模型和分析格式。
图5
在3D克隆性PDX乳腺癌和卵巢癌模型中，PRMT5和PARP抑制剂联合使用增强了生长抑制作用A, GSK3326595滴注联合570 nM(红色方框)或1800 nM(蓝色圆圈)尼拉帕尼治疗的乳腺3D克隆性体外PDX乳腺癌模型的平均超额Bliss和HSA评分。黑条表示GSK3326595与尼拉帕尼联合使用时的中位评分。B, GSK3326595滴注联合570 nM(红色方框)或1800 nM(蓝色圆圈)尼拉帕尼治疗的卵巢癌体外PDX模型的平均超Bliss和HSA评分。黑条表示GSK3326595与尼拉帕尼联合使用时的中位评分。C,D, MAXFHER 857乳腺癌模型(C)和OVXF OV109卵巢癌模型(D)中过度幸福和HSA对生长抑制的平均评分和相对于对照组的平均生长百分比
为了确定在体外观察到的PRMT5i和PARPi联合的抗增殖活性如何转化为体内的肿瘤生长抑制，我们在卵巢癌和乳腺癌细胞系异种移植中评估了该联合的疗效。携带MDA-MB-468(乳腺癌)或OVCAR-3(卵巢癌)异种移植物的小鼠被单独或联合给予GSK3326595或尼拉帕尼。作为单一疗法，在MDA-MB-468模型中，尼拉帕尼或GSK3326595治疗可显著抑制肿瘤生长(图6A)。然而，GSK3326595与尼拉帕尼联合用药，相对于单一药物或载体治疗组，可导致显著的抑制和最终的肿瘤停滞(图6A)。
图6
GSK3326595、尼拉帕尼或两者联合对乳腺癌和卵巢癌体内肿瘤生长的抑制作用A, GSK3326595、尼拉帕尼或联合用药在MDA-MB-468异种移植物模型中的疗效。携带MDA-MB-468肿瘤的NSG小鼠分别接受两种治疗，一种是载药(0.5%甲基纤维素)，另一种是每日2次口服GSK3326595 (50 mg/kg)，另一种是每日1次口服尼拉帕尼(35 mg/kg)，或者两种药物联合治疗(n=10)。B, GSK3326595、尼拉帕尼或联合用药在OVCAR3异种移植物模型中的疗效。研究人员对患有OVCAR-3肿瘤的CD.17 SCID小鼠进行了两种治疗，分别是每天两次口服PRMT5i (50 mg/kg)、每天一次口服尼拉帕尼(35 mg/kg)或两种药物联合治疗(n=10)。所有误差条表示平均值±SEM和学生t检验确定的显著性。* p≤0.05;** p≤0.01;*** p≤0.001;**** p≤0.0001
在OVCAR3模型中，相对于载体和GSK3326595，尼拉帕尼作为单一药物显著降低肿瘤生长，而GSK3326595对肿瘤体积没有显著影响(图6B)。然而，与所有其他给药组相比，GSK3326595和尼拉帕尼联合治疗导致肿瘤体积显著减少。此外，在联合用药的动物中，10个肿瘤中有9个几乎被完全根除，这表明PARP和PRMT5联合抑制在体内具有细胞毒性作用(图6B，补充图9A)。两种异种移植模型均耐受良好，MDA-MB-468组体重减轻不超过20%，OVCAR3组未观察到体重减轻(补充图9B)。总之，这些数据表明，在同等剂量的PRMT5i和PARPi具有适度效果的模型中，它们的组合可以产生几乎完全的肿瘤停滞或消退。
据推测，HR通路的缺失是传递PARP抑制剂敏感性的关键机制[文献48]。因此，调节肿瘤中HR通路的疗法可能为使癌细胞对PARP抑制敏感提供了一种可行的方法。在本报告中，我们将一种临床批准的PARP抑制剂与一种有效的、选择性的PRMT5抑制剂联合使用，在体外和体内均显示出更高的抗肿瘤活性。先前的报道已经确定了调节DNA修复的特定PRMT5底物，以及与PRMT5抑制剂和DNA损伤剂的组合[参考文献]。27日,49岁,50岁,51岁,52岁,53岁,54]。我们通过在更广泛的细胞系中评估临床使用的药物的活性来扩展这些发现，证明了多种机制的结合可以提高疗效。值得注意的是，这些细胞系都精通同源重组途径，这表明PRMT5抑制可以扩大PARP抑制剂在目前批准适应症之外的疗效。
在测试的细胞系中，PRMT5抑制不会导致从HR标记到NHEJ标记的可复制转移，这表明NHEJ和HR修复途径之间的选择并不总是受到影响。由于53BP1和RAD51分别是NHEJ和HR的早期标记物，我们的数据不排除PRMT5i破坏每个修复过程后期步骤的可能性[参考文献55]。几种机制可以解释PRMT5抑制后观察到的DNA损伤增加，包括DNA损伤的诱导或DNA复制或转录过程中积累的DNA断裂的修复失败。例如，抑制PRMT5会对DDX5 RNA解旋酶的剪接和甲基化产生广泛影响，从而可能导致DNA:RNA杂交体(R-loops)的稳定[参考文献]。[21,22,56,57]。转录过程中，新生RNA与DNA模板杂交形成三链结构，形成r环。当未解决时，r -环可导致DNA损伤的积累[参考文献]。58岁的59]。此外，PRMT5抑制可能会改变DNA损伤的解决和随后DNA损伤检查点的激活。PRMT5介导的甲基化和随后的53BP1稳定促进DNA损伤后的细胞存活[参考文献26]。53BP1的失稳或抑制抑制NHEJ并导致DNA损伤后细胞凋亡[参考文献60]。除了53BP1, PRMT5还通过转录因子、组蛋白和E3连接酶的甲基化调节DNA损伤的修复和解决[参考文献]。[26,49,50,51]。然而，prmt5i诱导的DNA损伤的确切机制尚不清楚，因为有许多可选择的剪接事件和甲基化底物调节DNA损伤和修复。此外，在细胞系之间观察到的DNA损伤的可变性表明，潜在的复杂性可能是由细胞系之间PRMT5底物的表达水平或每个细胞系优先使用的DNA损伤感知和修复机制的差异介导的。因此，确定最相关的底物可能会导致应用适当的药效学生物标志物来跟踪患者，以预测对该组合的最佳反应。
除了调节对DNA损伤的反应外，PARP和PRMT5的抑制剂已被证明可以激活癌细胞中的先天免疫信号通路，诱导免疫刺激基因(ISGs)的表达[参考文献]。61, 62, 63, 64, 65]。在人类肿瘤中，isg的表达增加与免疫浸润增加和对免疫检查点抑制剂的反应有关[参考文献]。66, 67, 68, 69]。因此，联合使用这些药物可能对ISG的诱导有协同作用，并进一步增强抗肿瘤免疫。在免疫活性模型中评估疗效可能揭示抗肿瘤活性的额外机制。
生物标记物的发现可以区分有反应和无反应的患者，以及联合策略的确定可以进一步扩大PARP抑制剂对更多患者的益处[参考文献]。10,11,12,13]。PARP抑制剂与负责ADMA产生的PRMT5或I型PRMTs联合使用的效果已分别在AML和NSCLC模型中观察到[参考文献]。70年,71]。然而，这些研究证明了目前尚未批准PARP治疗的肿瘤类型的联合疗效。鉴于PARP抑制剂niraparib和rucaparib目前被批准用于维持HR精通的癌症，PRMT5抑制可能代表一种组合，将PARP抑制的效用扩大到早期的治疗线。未来的机制研究可以通过优化给药方案来最大限度地减少治疗相关的毒性，并确定对联合治疗反应的预测性生物标志物，从而最大限度地提高临床活性。
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